The Innovation | 解密乙肝病毒受体的结构
导 读
钠离子牛磺胆酸共转运蛋白（NTCP），由SLC10A1基因编码，特异性地表达于肝脏细胞表面，负责胆酸、固醇类激素、甲状腺素和与胆酸共轭的药物等分子的转运，也是乙肝病毒（HBV）和丁肝病毒（HDV）进入肝脏细胞的功能性受体。近期，Nature、Cell Research相继发表四篇解析NTCP蛋白结构的文章。北京生命科学研究所齐湘兵与李文辉研究员针对以上文章进行了扼要点评，剖析文章中体现的科学问题，着重解读NTCP在参与胆酸分子转运、乙肝病毒结合中涉及的结构分子机制，并提出文章中尚未解决的问题以及展望。
图1 图文摘要
NTCP简介
2012年，NTCP被发现为乙型肝炎病毒（HBV）和丁型肝炎病毒（HDV）受体。十年来人们一直在试图阐明NTCP转运胆酸和介导HBV感染的结构基础和详细分子机制。近期四个研究团队分别开发了针对NTCP的抗体，并通过产生NTCP-抗体复合物的方法“放大”并稳定了NTCP的结构，从而通过冷冻电镜完成结构解析：Goutam等人报道NTCP与纳米抗体（Nb）复合物Nb87（NTCP-Nb87 3.7 Å）和Mb91（NTCP-Mb91 3.3 Å）的冷冻电镜结构；Park等人解析出NTCP与抗体（NTCP-Fab，3.3 Å）的复合物结构；Asami等人成功重构抗体与人NTCP（3.4 Å），牛NTCP（3.6 Å），和大鼠NTCP（3.1 Å）的复合物结构；Liu等人解析纳米抗体Fab12与人类野生型 NTCP的2.9 Å高分辨率低温电镜结构，揭示了胆酸识别和转运的结构基础，并提出胆酸转运的机理模型。
四篇文章均清晰地展示出NTCP的分子结构——主要由α-螺旋构成的九次跨膜蛋白（TM1-TM9）。这些相互连接的跨膜区组成了两个结构域，即由TM1、TM5、TM6构成的panel结构域和由TM2-4、TM7-9构成的core结构域。此外，core结构域中还包含一个由TM3和TM8组成的“X”形状的特征区域。通过解析不同抗体结合NTCP的复合体结构，研究人员得到了“向内开口”和“向外开口”构象不同的两个结构。前者拥有一个空腔体积较大（> 1500 Å3）的两亲性孔道，而后者的core和panel结构域会向相对的方向迁移约5 Å的距离。
NTCP的胆酸盐转运
ASBT作为顶端钠离子（Na+）依赖性胆酸转运体，是已报道过的SLC10蛋白家族成员。基于该蛋白结构中Na+所处的位置，上述四篇文章均对Na+在NTCP的保守结合位点进行了预测和验证，发现两个Na+与一个胆酸分子协同转运，而NTCP结合Na+后形成的“向外开口”构象也是HBV感染所必需的。然而，上述研究展示的受体及其复合物的静态结构仍存在自身局限性，Na+与胆酸共转运或病毒感染在NTCP构象动态变化中的作用仍需进一步研究。值得注意的是，根据以往研究结果，在细胞培养条件下，NTCP转运胆酸的能力高度依赖于细胞内外Na+的浓度梯度，而HBV病毒Pre-S1区域与NTCP的结合则对Na+浓度相对不敏感，说明Na+驱动的胆酸转运与HBV感染在NTCP作用机制上依然有所差异。
四篇文章也分别对胆酸分子在NTCP的结合位置进行研究：Goutam等人认为，在结构重排中形成的两亲性开放空间，可用于分子的结合与转运；Park等人则提供了更多的动力学依据，推测core和panel结构域的相对位置变动创造了胆酸分子结合的空间，并借助细胞内外Na+的相对浓度差驱使胆酸盐转运；Asami等人在疏水通道内观察到两个类似脂类或者胆酸的分子，其中一个与牛磺胆酸在ASBT结构中的结合位置类似。然而，由于在实验体系中均存在脂类物质，作者无法确定这些结合位点是否确实参与了胆酸盐转运。有意思的是，Liu等人清楚地观察到了与胆酸盐的多环骨架结构一致的两个强电子密度特征。值得注意的是，基于这两个与胆酸盐的高分辨率结构，他们提出了一种NTCP介导的胆酸盐转运机制，即一个胆酸分子与两个Na+一起释放到细胞质中，而另一个胆酸分子与转运蛋白保持结合状态，从而阻止离子泄漏。
NTCP与HBV感染
现有生化与遗传学证据表明，由NTCP介导的HBV/HDV感染，对NTCP的氨基酸序列高度敏感，关键位置上几个氨基酸（如A64，K86，N87，K157，G158，V263，或S267）的变化足以影响HBV/HDV的结合或者感染过程。例如，胞外区的Lys86和Asn87对病毒感染有重要作用：普通小鼠无法感染HBV/HDV病毒，但将小鼠NTCP上H84，T86和S87替换为人NTCP对应位点上的氨基酸后，可以使小鼠对HDV病毒易感。K157-L165区域是人和猴NTCP序列上的主要差别之一，体外细胞实验表明，将猴NTCP157-165的片段替换为人NTCP等位氨基酸片段，获得的嵌合体NTCP能够支持HBV/HDV的感染。
Goutam等人利用荧光标记HBV Pre-S1多肽，分析NTCP“向内开口”构象（NTCP-Nb87）与“向外开口”构象（NTCP-Nb91）之间的区别，提出Pre-S1更倾向于结合NTCP“向外开口”构象，并与core和panel结构域之间暴露的氨基酸残基（N262，S267和L294）相互作用，同时观察到TM5胞外区的K157-L165区域也参与其中。作者提出Pre-S1与NTCP的结合有可能会将NTCP稳定在“向外开口”构象上，从而影响胆酸盐的转运。这些结构上的证据表明，通过变构调节NTCP构象，使之固定于相反的“向内开口”状态，有可能达到阻碍HBV感染的目的。
Park等人对Pre-S1上N9与NTCP上K86、N87之间的相互作用进行了推测：这些氨基酸残基与可能的胆酸结合位点，L157/G158，在空间上相距较远，约30 Å，提示了开发出阻碍HBV感染的抑制剂而不影响NTCP生理功能的可能性。
以往研究表明，HBV的感染依赖于Pre-S1前端的十四烷基豆蔻酰化修饰。Asami等人通过分析NTCP、抗体Fab、Pre-S1三者所构成的复合体结构，推测豆蔻酰化修饰的Pre-S1与NTCP的结合位点位于其转运通道的膜表面区域，靠近G158和S267的氨基酸残基。然而，受限于该区域氨基酸残基与Pre-S1电子密度分辨率，豆蔻酰化侧链的具体位置仍无法完全确定。
总结与展望
通过整合生化和遗传数据，以上研究中提供的新数据揭示了NTCP与胆酸结合、转运以及HBV感染的结构信息。然而，这些步骤具体的动力学机制仍不清楚。Goutam和Asami等人均观察到了NTCP结构存在两亲性空穴，提示NTCP可能通过形成寡聚物复合体发挥功能，而该空穴区域可能是NTCP寡聚化的结合位点所在区域。后续研究中，更高精度的NTCP结构解析或NTCP与胆酸、病毒Pre-S1复合物结合的高清分辨率数据将有助于进一步厘清NTCP相关行为的具体位置与方式。
自巴洛克·布隆伯格发现乙肝病毒以来，科学界在探索乙肝机理与治疗的道路上取得了一系列成果，然而目前的抗病毒疗法仍无法完全清除HBV病毒。科学家们仍在不懈地探索彻底治愈乙肝的方法。NTCP结构的解析为基于结构研发抗乙肝病毒感染药物提供了可能。越来越多的证据表明，HBV在肝内的慢性感染离不开病毒持续不断的再感染过程。因此，乙肝病毒受体抑制剂将成为现有治疗方法的强有力补充，促进实现HBV临床功能性治愈。
